Las células madre mesenquimales (MSC) tienen una amplia gama de fuentes. Las MSC derivadas de la médula ósea han sido las más estudiadas, pero su capacidad proliferativa es relativamente débil y disminuye con la edad del donante. Las MSC derivadas del tejido adiposo son fáciles de obtener, tienen una mejor capacidad inmunomoduladora que las derivadas de la médula ósea y exhiben una fuerte capacidad proliferativa en la etapa inicial. Las MSC derivadas del cordón umbilical, conocidas por sus características de 'células de edad cero' y su baja inmunogenicidad, son muy favorecidas y se han convertido en un foco de investigación. Por lo tanto, en la transformación y aplicación clínica, se lleva a cabo más comúnmente el uso de MSC derivadas del cordón umbilical y del tejido adiposo.
El procesamiento de muestras, como 'primer paso' en el cultivo in vitro de MSC, determina directamente el éxito o el fracaso de experimentos posteriores. Esta guía se centrará principalmente en los problemas comunes en la selección y el procesamiento de muestras de cordón umbilical, lo que le ayudará a tener un buen comienzo antes del cultivo.
P: ¿Cómo seleccionar cordones umbilicales calificados para cultivar MSC derivadas de cordones umbilicales?
La selección de cordones umbilicales también es un vínculo crucial para la realización fluida del experimento de aislamiento primario de MSC de cordón umbilical.
Condiciones de un cordón umbilical de alta calidad:
Sin edema o congestión evidentes en el cordón umbilical;
Jalea espesa de Wharton (WJ) en el cordón umbilical;
Cordón umbilical fresco, utilizado preferentemente inmediatamente después de su recolección y no deberá almacenarse por más de 48 horas;
La madre donante no tiene enfermedades infecciosas.
Condiciones de almacenamiento y transporte de cordones umbilicales:
El cordón umbilical debe almacenarse en una solución de conservación a 4 ℃. Si se transporta en estado seco, es propenso a sufrir edema y a una lenta migración celular fuera del tejido;
El cordón umbilical debe utilizarse dentro de las 48 horas posteriores a su extracción; existe una cierta probabilidad de que ninguna célula migre fuera del cordón umbilical almacenado durante más de 72 horas;
El cordón umbilical debe almacenarse en una solución de conservación que contenga un 1% de antibióticos; de lo contrario, existe un alto riesgo de contaminación.
P: ¿Qué cuestiones se deben tener en cuenta al seleccionar los cordones umbilicales?
El edema del cordón umbilical y la gelatina de Wharton transparente o translúcida pueden provocar que menos células y más lentamente migren fuera de los bloques de tejido;
Los cordones umbilicales torcidos o atróficos pueden provocar una lenta migración celular fuera de los bloques de tejido;
La congestión grave del cordón umbilical puede provocar una lenta migración celular fuera de los bloques de tejido y se puede observar una gran cantidad de glóbulos rojos en la placa de cultivo;
Una operación incorrecta durante el corte y extracción del cordón umbilical de la sala de partos puede provocar contaminación.
Soluciones recomendadas:
Seleccione cordones umbilicales regordetes sin edema ni congestión severa y corte las partes pequeñas edematosas, atróficas o congestionadas. Si el laboratorio no experimenta contaminación frecuente, el cordón umbilical se puede enjuagar de 3 a 5 veces con solución salina que contenga 1% de anticuerpos dobles (penicilina y estreptomicina) o 25 mg/l de gentamicina. Si se detecta contaminación con frecuencia, primero enjuague el cordón umbilical con etanol al 75% durante 40 a 60 segundos, luego lávelo de 10 a 20 veces con una gran cantidad de solución salina que contenga 1% de anticuerpos dobles.
P: ¿Cuáles son las clasificaciones de las células madre mesenquimales del cordón umbilical?
El cordón umbilical es un tejido similar a un cordón que conecta al feto y la placenta, responsable del intercambio de gases, el suministro de nutrientes y la excreción de productos metabólicos entre la madre y el feto. Sus características básicas son las siguientes:
Tiempo de desarrollo: comienza a desarrollarse entre 4 y 8 semanas después de la formación del embrión humano;
Datos morfológicos: Largo promedio 55 cm, diámetro 14,42 mm, peso 40 g;
Composición estructural: Cubierto con membrana amniótica (blanquecina) en la superficie, contiene 1 vena umbilical y 2 arterias umbilicales en su interior. Rodeando los vasos sanguíneos hay un tejido coloidal incoloro y translúcido: la gelatina de Wharton (WJ), cuya función principal es proteger los vasos sanguíneos umbilicales.
Las células madre mesenquimales se pueden obtener de cuatro compartimentos diferentes del cordón umbilical y se clasifican en los siguientes cuatro tipos según sus fuentes: células madre mesenquimales de gelatina de Wharton (WJ-MSC), células madre mesenquimales perivasculares (PV-MSC), células madre mesenquimales subamnióticas (SA-MSC) y células madre mesenquimales amnióticas (AM-MSC). Las células madre mesenquimales de estos cuatro compartimentos tienen diferentes métodos de aislamiento.
P: ¿Cuáles son las ventajas de las células madre mesenquimales gelatinosas (WJ-MSC) de Wharton?
En comparación con las células madre mesenquimales de otros compartimentos del cordón umbilical, las WJ-MSC funcionan mejor en términos de capacidad proliferativa, potencial de diferenciación, seguridad, etc.:
Ventajas de cantidad y aislamiento: la gelatina de Wharton representa una gran proporción del cordón umbilical, tiene la mayor superficie y volumen y contiene muchas más células madre mesenquimales estrelladas que otras regiones. Su aislamiento no requiere un tratamiento enzimático complejo y se pueden obtener suficientes células mediante un cultivo a corto plazo, lo que no solo garantiza la viabilidad y la pureza, sino que también reduce el riesgo de contaminación microbiana durante el cultivo.
Mayor potencial de diferenciación: las WJ-MSC tienen capacidades de diferenciación osteogénica y condrogénica más prominentes, una mayor tasa de supervivencia y tasa de proliferación, así como capacidades de proliferación y regeneración más fuertes.
Mayor seguridad: Baja inmunogenicidad, no expresa MHC-Ⅱ; no tumorigénico y posee propiedades antiinflamatorias.
P: ¿Cómo aislar Wharton's Jelly del cordón umbilical?
Utilice tijeras médicas para cortar el cordón umbilical en segmentos de tejido de 2 cm e incidir cada segmento a lo largo de la vena umbilical. Utilice pinzas para tejidos para despegar la íntima de la vena umbilical, la piel exterior y las dos arterias umbilicales para exponer completamente la gelatina de Wharton.
La gelatina de Wharton debe quedar completamente despojada de los tres vasos sanguíneos y de la epidermis exterior. Si no se eliminan por completo, las células heterólogas de tipo epitelial migrarán, lo que ocupará el espacio de crecimiento de las MSC y dará como resultado un número reducido de células recolectadas. Estas células son difíciles de digerir con enzimas suaves y pueden eliminarse mediante pasaje. El cordón umbilical procesado se puede utilizar para una inoculación posterior mediante el método de implantación.
P: ¿Qué cuestiones se deben tener en cuenta durante la inoculación mediante el método de implantación?
Cortar en bloques
La Jalea de Wharton aislada se debe cortar en trozos pequeños de unos 3 mm. Si los trozos de tejido son demasiado pequeños, será difícil adherirse a la pared, lo que provocará que ninguna o muy pocas células migren. Si los trozos de tejido son demasiado grandes o no están completamente cortados, ninguna célula migrará tampoco. Si los trozos de tejido se trituran completamente con unas tijeras, es probable que el cultivo celular primario falle.
Inoculación
Los trozos de tejido deben inocularse en un medio adecuado según el tamaño de la placa/matraz de cultivo y se debe agregar una cantidad adecuada de medio de cultivo. Muy poco medio de cultivo impedirá que las células migren fuera de los trozos de tejido, mientras que demasiado hará que los trozos de tejido floten y las células aún no migrarán.
Después de la inoculación, se debe evitar en la medida de lo posible el movimiento de los trozos de tejido. Es mejor mantenerlos completamente tranquilos en la incubadora durante los primeros 7 días, excepto para la suplementación media. El movimiento frecuente hará que los trozos de tejido se suspendan, lo que imposibilitará la migración de las células.
