Reconocemos plenamente la diversidad de realidades industriales: algunos clientes ya han establecido bancos de células madre bajo sistemas suero/sustituto de suero o han completado el aislamiento primario de células utilizando protocolos que contienen suero. Para los equipos con una determinada base de investigación o producción, una preocupación técnica común es cómo convertir de manera fluida y eficiente los recursos celulares existentes en un sistema de cultivo sin suero y al mismo tiempo garantizar la estabilidad de la viabilidad, el fenotipo y la función de las células. ¿Cuál es el secreto para una transición sin problemas a un sistema de cultivo sin suero? ¿Qué puntos clave se deben tener en cuenta durante la conversión? ¿Hay algún caso exitoso como referencia? Hoy compartiremos ideas sobre estos temas.
Consideraciones clave para convertir MSC de medios suero/sustitutos de suero a medios sin suero
1. Digestión y Terminación
Utilice el método de digestión original: al transferir directamente células cultivadas en suero o medios sustitutos de suero a medios sin suero, se debe conservar el método de digestión original, junto con el método de terminación específico del medio original. Posteriormente, centrifugar para eliminar las enzimas digestivas.
Evite el daño inducido por la digestión: las MSC cultivadas en suero o medios sustitutos del suero generalmente exhiben una fuerte adherencia. La digestión con tripsina o enzimas similares puede requerir una duración más prolongada, lo que aumenta el riesgo de daño celular. Por lo tanto, es fundamental contar las células antes de sembrarlas e inocularlas en función del número de células viables.
Se recomienda realizar una prueba previa: algunas muestras de células pueden mostrar un crecimiento anormal. Es aconsejable realizar una prueba previa del rendimiento de crecimiento de células específicas en el medio sin suero.
2. Densidad de siembra
Ajustar la densidad por paso celular:
Células en el pase 3 o anterior: Semillas a 8000 células viables/cm²;
Células después del pase 3: Sembrar a 10.000 células viables/cm².
Considere el estado de las células: si las células se congelaron en medios que contienen suero, generalmente es factible la transferencia directa a medios sin suero. Sin embargo, si surgen problemas de adaptabilidad, se recomienda descongelarlo y pasarlo una vez en el medio original antes de realizar la transición al sistema sin suero.
3. Método de siembra
Evite enjuagar el fondo del recipiente de cultivo: agregue medio a lo largo de la superficie superior o la pared lateral del recipiente de cultivo; nunca vierta directamente sobre el fondo (superficie de crecimiento celular). Esto evita la formación de áreas en blanco 'parecidas a lagos' o 'ríos', que pueden dificultar la adhesión y el crecimiento celular.
Procedimiento operativo estándar: agregue lentamente medio a lo largo de la pared del recipiente o directamente en el fondo usando una pipeta. Incline suavemente el recipiente para asegurar una humectación uniforme de la superficie de crecimiento y luego agregue la suspensión celular. Agite el recipiente suavemente para distribuir las células de manera uniforme.
4. Monitoreo de paso y cultura.
Momento óptimo de paso: después de transferir las células a medios sin suero, incubar durante 72 horas. Monitorear bajo un microscopio: paso cuando la confluencia celular alcanza el 90%. Evite exceder el 100% de confluencia, ya que el hacinamiento, la estratificación o la formación de esferoides pueden provocar senescencia, diferenciación o daño grave de las células durante la digestión.
Precauciones de paso:
a. Utilice una enzima digestiva suave de células madre. Ajuste el volumen de enzima y el tiempo de digestión según el tipo de recipiente de cultivo (normalmente de 3 a 5 minutos a temperatura ambiente).
b. Inmediatamente después de la digestión, diluir la suspensión celular con 2 volúmenes de medio completo o sobrenadante y pipetear suavemente. Complete todo el proceso en 10 minutos y centrifugue rápidamente para minimizar el daño mecánico.
do. Resuspender las células después de la centrifugación y volver a sembrar en las densidades específicas de paso mencionadas anteriormente (8000 o 10.000 células viables/cm²).
5. Descongelación de células congeladas de sistemas suero/sustituto de suero
Para las células congeladas-descongeladas, se recomienda descongelarlas primero y pasarlas una vez en el medio original antes de pasar a medios sin suero. Si se intenta la descongelación directa en medios sin suero, realice pruebas operativas según el manual del producto para confirmar la adhesión y el paso celular normales. Si surgen problemas, vuelva al paso de transición intermedio.
Durante la descongelación, siga las mismas pautas para la adición de medio (evite enjuagar el fondo), la densidad de siembra (basada en el recuento de células viables y las reglas de paso) y los procedimientos de digestión/centrifugación que en el paso de rutina.
Soluciones tecnológicas de conversión de sistemas y estudios de casos de Yocon
1. Sustituto de suero importado → Sistema Yocon
Las células congeladas-descongeladas se transfirieron directamente al sistema de cultivo sin suero de Yocon. La estabilidad del fenotipo se logró después de 3 pases consecutivos, sin anomalías posteriores: la conversión se completó con éxito.
2. Sustituto de suero doméstico → Sistema Yocon
Las células congeladas-descongeladas se transfirieron directamente al sistema de cultivo sin suero de Yocon. Las células exhibieron adhesión y expansión normales, con cantidad y rendimiento celulares estables después de pases continuos.
3. Sustituto de suero importado → Sistema Yocon
Las células congeladas-descongeladas se transfirieron directamente al sistema de cultivo sin suero de Yocon. El crecimiento fue ligeramente más lento en los primeros tres días debido al estado celular inicial. Después de un cambio completo de medio, las células recuperaron una morfología densa y extendida el día 6: conversión exitosa del sistema.
4. Suero fetal bovino (FBS): células congeladas → Sistema Yocon
Las células semilla P2 congeladas en un medio basal importado + FBS se descongelaron directamente en el sistema de cultivo sin suero de Yocon. Se produjeron problemas menores de adhesión debido al estado celular inicial, pero la proliferación celular y la capacidad de adhesión se recuperaron por completo el día 7 después del paso.
YOCON
El cultivo sin suero se ha convertido en una clara tendencia de desarrollo en el campo de la terapia celular. Aborda fundamentalmente los desafíos de los componentes indefinidos, la variabilidad entre lotes y los riesgos de contaminación de origen animal asociados con los cultivos que contienen suero, cumpliendo con los estrictos requisitos de estandarización, seguridad y consistencia en productos celulares de grado clínico. Con la mejora continua de las regulaciones relevantes y la creciente demanda del mercado, los medios sin suero definidos químicamente representan un camino inevitable para la producción automatizada, de alta calidad y a gran escala de células madre. Esto no es simplemente una mejora tecnológica, sino un paso industrial crítico hacia el avance de las terapias con células madre desde la investigación de laboratorio hasta la aplicación clínica generalizada.
