Como tecnología de vanguardia en el campo de las células madre, las células madre pluripotentes inducidas (iPSC) han demostrado importantes barreras técnicas y un amplio potencial de mercado, gracias a su capacidad proliferativa y diferenciadora ilimitada, junto con tecnologías de reprogramación innovadoras. Las proyecciones indican que el mercado mundial de células madre alcanzará los 270.500 millones de dólares en 2025, y el segmento de iPSC contará con una tasa de crecimiento anual compuesto (CAGR) superior al 13,8%.
Detrás de este avance industrial se encuentran las propiedades biológicas únicas de las iPSC: pueden autorrenovarse para mantener una población celular estable y diferenciarse en casi todos los tipos de células del cuerpo humano, incluidas las células neurales, los cardiomiocitos y las células pancreáticas. Derivadas de células somáticas, las iPSC eliminan las restricciones en la recolección de muestras, lo que las convierte en una fuente de 'semilla' ideal para terapias celulares dirigidas a diversas enfermedades.
Sin embargo, las iPSC son extremadamente sensibles incluso a cambios menores en el entorno cultural, lo que a menudo conduce a desafíos como una diferenciación no deseada y una mala adherencia. Garantizar el mantenimiento de la pluripotencia y prevenir la diferenciación espontánea requiere un control preciso de las condiciones de cultivo. Este artículo sintetiza los elementos centrales de la cultura iPSC, describiendo sistemáticamente procesos clave, causas de diferenciación y soluciones correspondientes para servir como referencia para el cultivo estandarizado.
I. Establecimiento del sistema cultural
El mantenimiento de la potencia de las iPSC depende de una regulación precisa del microambiente, centrándose en tres componentes principales: medio de cultivo, sustrato y condiciones ambientales.
1. Medio de cultivo: equilibrio entre nutrición y señalización
Como 'fuente nutricional' para el crecimiento de las iPSC, la fórmula del medio afecta directamente el estado de las células y desempeña un papel fundamental en el mantenimiento de la estabilidad y la funcionalidad. Se recomiendan como opción preferida los medios sin suero (p. ej., el kit de medio sin suero iPSC de Yocon). Estos medios contienen combinaciones optimizadas de factores de crecimiento que activan vías de mantenimiento del tallo, como FGF2/ERK, apoyando el cultivo sin alimentador, inhibiendo eficazmente la diferenciación espontánea y permitiendo pases a largo plazo.
Una operación crítica: el FGF-2 tiene una vida media de menos de 24 horas, lo que requiere una suplementación oportuna para evitar la diferenciación debido a una señalización insuficiente. El medio sin suero iPSC de Yocon utiliza FGF-2 termoestable, que ofrece una vida media más larga y una actividad biológica más alta y estable, lo que permite cambios de medio cada dos días.
2. Sustrato: soporte de adhesión y crecimiento
El cultivo temprano de iPSC a menudo dependía de fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) como alimentadores, que secretan factores que promueven el crecimiento de iPSC y el mantenimiento de la pluripotencia. Sin embargo, los MEF conllevan el riesgo de contaminación xenogénica, lo que hace que el cultivo sin comederos sea la corriente principal actual. Los sistemas sin alimentador suelen utilizar geles de matriz como Matrigel, un extracto de membrana basal que imita la matriz extracelular y proporciona una adhesión óptima y un apoyo al crecimiento de las iPSC.
Una operación crítica: cuando use Matrigel, tome alícuotas de acuerdo con el volumen recomendado por el fabricante según el número de lote. Diluir cada alícuota con 36 ml de DMEM/F12 frío, cubrir los pocillos y realizar todo el proceso en hielo. Incubar a 37 °C durante 1 a 2 horas para garantizar la polimerización completa de la matriz, creando una superficie adhesiva estable para las células.
3. Medio ambiente: control preciso y estable
Un ambiente y una temperatura de gas estables y adecuados son esenciales para un crecimiento saludable de iPSC. Las incubadoras deben configurarse a 37 °C para mantener el metabolismo celular y las actividades fisiológicas normales, con un 5 % de CO₂ para estabilizar el pH del medio. Además, controle la humedad de la incubadora para evitar la evaporación del medio: coloque una bandeja de agua en el fondo y reponga el agua con regularidad.
II. Procesos operativos centrales y detalles clave
1. Pasaje
Las iPSC crecen en colonias y están listas para pasar cuando las colonias se vuelven grandes, con centros densos y brillantes (en comparación con sus bordes) y las colonias adyacentes comienzan a fusionarse. El ciclo de pases varía de 3 a 5 días, dependiendo del tamaño y densidad de los grupos de células inoculadas. Pasar demasiado pronto o con frecuencia puede provocar una mala adhesión, un rendimiento reducido y una diferenciación. Por el contrario, el paso retrasado produce hacinamiento, competencia por nutrientes y diferenciación (p. ej., morfología celular alterada, disminución de la expresión de marcadores de pluripotencia), comprometiendo los resultados experimentales.
Para la disociación se utilizan habitualmente enzimas digestivas suaves que contienen EDTA (p. ej., Accutase o Tryple). El EDTA quela el calcio extracelular, debilitando la adhesión célula-célula y célula-matriz para mejorar la eficiencia de la digestión. Controle el tiempo de digestión a 3-5 minutos para evitar una digestión excesiva.
Después de terminar la digestión, pipetear suavemente y pasar como células individuales o pequeños grupos. Las iPSC tienen poca viabilidad y mantenimiento del tallo en el estado unicelular, lo que hace que la diferenciación espontánea sea más probable. Si se requiere pase de una sola célula, agregue Y27632 a una concentración final de 10 μM.
Paso cuando la confluencia celular alcanza aproximadamente el 90%, con una proporción recomendada de 1:20 (ajustable según la confluencia real). Cuente las células antes de pasarlas: siembre entre 100 000 y 200 000 células por pocillo en una placa de 6 pocillos para garantizar un espacio de crecimiento suficiente y al mismo tiempo mantener una densidad celular óptima para la señalización y el crecimiento intercelular.
2. Criopreservación
Antes de la criopreservación, retire cuidadosamente las regiones diferenciadas bajo un microscopio utilizando una punta de pipeta u otras herramientas de precisión. Las células diferenciadas se desvían de las características de las células madre y pueden alterar la estabilidad de todo el sistema de cultivo después de la descongelación. Asegúrese de que solo se eliminen las células diferenciadas sin dañar las iPSC sanas. Criopreservar las iPSC cuando estén en buenas condiciones y con la densidad adecuada.
3. Control de calidad
(1) Monitoreo de la estabilidad genómica
El cultivo de iPSC a largo plazo puede inducir mutaciones genéticas, lo que afecta la calidad de las células y la seguridad de la aplicación. Realice análisis de cariotipo con regularidad (p. ej., cada 10 a 20 pases) utilizando bandas del cromosoma G para detectar anomalías en el número, la morfología y la estructura de los cromosomas. Elimine rápidamente las células anormales para evitar su acumulación en el sistema de cultivo.
(2) Identificación de pluripotencia
La pluripotencia es la característica principal de las iPSC, identificable mediante la detección de la expresión de marcadores de pluripotencia como TRA-1-60 y Oct4. Los métodos incluyen tinción por inmunofluorescencia (visualización de la localización e intensidad del marcador), citometría de flujo (cuantificación de células que expresan positivamente) y RT-PCR (detección de la expresión del marcador a nivel de ARNm). Sólo las iPSC con alta expresión de marcadores de pluripotencia poseen un fuerte potencial de aplicación.
III. Problemas y soluciones comunes de la cultura iPSC
1. Diferenciación: causas fundamentales y remedios eficaces
(1) Causas principales
Desequilibrio del microambiente: las variaciones de un lote a otro en los geles de matriz alteran la adhesión y las señales de los factores de crecimiento, lo que altera el mantenimiento del tallo. El daño mecánico causado por el pipeteo excesivo también desencadena respuestas de estrés y diferenciación celular.
Estrés metabólico: las iPSC tienen una alta actividad metabólica y producen lactato y otros metabolitos. Los cambios retardados en el medio provocan acumulación de lactato y disminución del pH (por debajo de 7,2), lo que interfiere con la actividad enzimática y las vías de señalización, y promueve la diferenciación. La suplementación insuficiente de factores de crecimiento de vida media corta (p. ej., FGF-2) debilita las señales que mantienen la potencia.
Hacinamiento celular: las iPSC carecen de inhibición de contacto. Las colonias demasiado crecidas causan agotamiento de nutrientes y acumulación de desechos en las células centrales, lo que induce la diferenciación ectodérmica. La inhibición del contacto desequilibrada en las células marginales promueve la diferenciación mesodérmica.
(2) Remedios
Pasajes de alta proporción (≥1:20): diluya las células diferenciadas y seleccione colonias de alta calidad (morfología densa, bordes claros, buena refractividad) para mantener la pluripotencia.
Tratamiento local para tasas de diferenciación bajas: raspe con cuidado las regiones diferenciadas bajo un microscopio con una punta de pipeta de 10 μl, evitando dañar las células indiferenciadas y la capa de matriz. Reemplace con medio nuevo inmediatamente para eliminar las señales residuales que inducen la diferenciación.
Adición de inhibidores para tendencias de diferenciación de trilinajes: agregue concentraciones apropiadas de inhibidores y controle de cerca el estado celular. Reduzca gradualmente la dosis del inhibidor después de 3 a 5 pases para evitar efectos adversos sobre la potencia.
Deseche los cultivos muy diferenciados: si las regiones diferenciadas ocupan la mayoría de las colonias, deseche el lote y descongele un vial nuevo.
2. Baja eficiencia de descongelación: el éxito depende de los detalles operativos
(1) Causas comunes
El pipeteo excesivo dispersa las células en células individuales, que tienen poca viabilidad y mantenimiento del tallo. Los grupos de células de tamaño insuficiente después de la descongelación también reducen la supervivencia debido a la interrupción del soporte intercelular.
(2) Medidas de optimización
Ajuste la técnica de pipeteo: Pipetee suavemente y minimice el número de pasadas para reducir el daño mecánico.
Verifique el tamaño del grupo después de la descongelación: use un microscopio para verificar el tamaño óptimo del grupo. Ajuste la frecuencia y la frecuencia del pipeteo en la descongelación posterior para formar grupos más grandes y estables.
Agregue Y27632 durante la descongelación para mejorar la supervivencia celular.
3. Mala adherencia después del paso: la digestión y el tamaño del racimo son clave
(1) Causas comunes
Sobredigestión: la digestión prolongada degrada las moléculas de adhesión de la superficie celular, perjudicando la adherencia.
Pipeteo inadecuado: el pipeteo excesivo o contundente reduce el tamaño del grupo, lo que disminuye el área de contacto con la placa de cultivo y provoca daños mecánicos.
Digestión insuficiente: una digestión insuficiente requiere un pipeteo contundente para separar las células, lo que daña las membranas celulares y el citoesqueleto.
Revestimiento de matriz incompleto: la solidificación prematura del gel de matriz (debido a una manipulación inadecuada) provoca un revestimiento desigual.
(2) Medidas de optimización
Controlar el tiempo de digestión: monitorear las células bajo un microscopio; Termine la digestión inmediatamente cuando las células se redondeen ligeramente y las membranas se arruguen.
Mejore la técnica de pipeteo: reduzca los trazos y mantenga un tamaño de racimo uniforme y moderado.
Amplíe ligeramente el tiempo de digestión de las células adheridas obstinadamente para minimizar la interferencia mecánica.
Realice un recubrimiento de matriz sobre hielo para evitar una solidificación prematura.
IV. Kit mediano sin suero iPSC de Yocon
Con años de enfoque en I+D y producción de productos de cultivo sin suero para terapia celular, Yocon ha lanzado el kit de medio sin suero iPSC. Diseñado específicamente para la expansión estable y el mantenimiento a largo plazo de células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSC), este kit ofrece alta eficiencia, estabilidad y composición definida, adecuado para diversas aplicaciones.
Características clave del kit medio sin suero iPSC:
Medio sin suero químicamente definido para la expansión in vitro y el cultivo a largo plazo de hiPSC.
Fórmula científicamente optimizada con citoquinas termoestables y un robusto sistema de amortiguación.
Admite cambios de medio cada dos días y paso de una sola celda, lo que permite una operación simple y versátil.
Rendimiento de expansión superior: admite más de 30 pasajes en cultivo sin alimentador, con cariotipo normal y sin diferenciación significativa.
Las iPSC continúan revolucionando la medicina regenerativa y el desarrollo de fármacos. Al dominar los principios básicos del establecimiento de sistemas de cultivo, las operaciones estandarizadas y la resolución de problemas, los investigadores pueden garantizar la calidad y estabilidad de las iPSC, liberando todo su potencial en la traducción clínica y la investigación científica.
